BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar
Belakang
Mikroorganisme dapat tumbuh dan
berkembang biak dengan cara mengoksidasi zat-zat hara yang ada di lingkungan
untuk menghasilkan energi dan senyawa awal untuk sintesis komponen-komponen
sel. Penggunaan zat hara dipengaruhi oleh aktivitas metabolisme mikroorganisme
dalam memecah molekul kompleks, seperti karbohidrat, protein, lemak, dan asam
nukleat menjadi komponen yang lebih sederhana sehingga dapat diangkut sel ke
sitoplasma sebagai sumber energi dan senyawa awal.
Proses pemecahan karbohidrat dan asam
amino secara anaerobik disebut dengan fermentasi sedangkan proses penguraian
makromolekul menjadi molekul yang lebih sederhana dengan penambahan air disebut
juga dengan hidrolisis. Mikroorganisme dapat menghasilkan enzim yang dapat
mengkatalis reaksi hidrolisis.
Mikroorganisme amilolitik dapat
memproduksi enzim amilase untuk memecah pati menjadi gula yang lebih sederhana yang
dapat dipecah lagi menjadi asam, gas, alkohol, dan energi. Mikroorganisme
proteolitik dapat menghidrolisis protein dan menghasilkan peptida serta asam
amino. Mikroorganisme lipolitik dapat memecah lemak menjadi asam lemak dan
gliserol, sedangkan mikroorganisme pektolitik dapat memecah pektin dan
menyebabkan hilangnya kemampuan membentuk gel. Mikroorganisme di lingkungan
aerob juga dapat menghasilkan enzim katalase untuk menguraikan hidrogen
peroksida (H2O2) menjadi air dan O2. H2O2
bersifat toksik terhadap sel karena dapat menginaktivasi enzim yang ada di
dalam sel.
Pewarnaan Gram dapat digunakan untuk
membedakan antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Adanya
perbedaan pada tahap pewarnaan Gram disebabkan oleh perbedaan struktur dinding
sel yang dimiliki bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Komponen utama
bakteri Gram positif adalah peptidoglikan sedangkan sebagian besar dinding sel
bakteri Gram negatif tersusun dari lipid.
1.2 Tujuan
Percobaan ini bertujuan untuk mempelajari
sifat-sifat pemecahan komponen kimia di dalam makanan oleh mikroorganisme, seperti
bakteri, kapang, dan khamir, menguji dan membedakan reaksi pemecahan
karbohidrat, protein, dan lemak oleh kultur jasad renik murni dan
mikroorganisme yang ada di makanan, mengetahui adanya enzim katalase pada
mikroorganisme melalui uji katalase, dan dapat mengamati bentuk dan ciri-ciri
dari bakteri melalui pewarnaan Gram.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Menurut Lay (1994), mikroorganisme
dapat tumbuh, berkembang biak, dan membentuk sel baru dengan menggunakan zat
hara yang ada di lingkungannya, yaitu molekul sederhana, seperti H2S
dan NH4+ atau molekul organik kompleks, seperti
polisakarida dan protein. Zat-zat hara ini akan dioksidasikan oleh
mikroorganisme untuk mendapatkan energi dan senyawa awal agar dapat melakukan
sintesis dinding sel, membran sel, dan flagela.
Penggunaan zat hara ditentukan dari
aktivitas metabolisme mikroorganisme. Metabolisme dapat memberikan hasil
sampingan yang dapat dipakai untuk mengidentifikasi mikroorganisme. Salah satu
jalur metabolisme adalah fermentasi yang pemindahan elektronnya berlangsung di
antara senyawa-senyawa organik (Volk dan Wheeler, 1993).
2.1 Fermentasi
Menurut Fardiaz (1992), fermentasi
adalah proses pemecahan komponen karbohidrat dan asam
amino oleh enzim mikroorganisme secara anaerobik untuk menghasilkan energi.
Proses ini tidak memerlukan adanya oksigen dan pada saat fermentasi
berlangsung, senyawa organik berperan sebagai penerima elektron terakhir sehingga
hasil fermentasinya lebih stabil. Pada proses fermentasi, hanya sebagian bahan
baku energi yang dipecah sehingga hanya dihasilkan sejumlah kecil energi, CO2,
air, dan beberapa produk akhir, seperti asam laktat, asam asetat, etanol, serta
asam organik volatil lainnya (Buckle et
al., 1987). Karbohidrat merupakan senyawa utama yang dipecah dalam proses
fermentasi sedangkan asam amino hanya dapat dipecah oleh beberapa jenis bakteri
tertentu (Fardiaz, 1992).
2.1.1
Fermentasi Karbohidrat
Karbohidrat merupakan komponen utama
yang dipecah di dalam proses fermentasi. Pertama, polisakarida akan dipecah
menjadi gula-gula sederhana sebelum dilakukan fermentasi, contohnya pati
dipecah menjadi glukosa-glukosa. Selanjutnya, glukosa dipecah lagi menjadi
senyawa-senyawa lain yang lebih sederhana tergantung pada jenis fermentasinya
(Fardiaz, 1992).
Selain itu, hasil akhir produk fermentasi juga
dipengaruhi dari sifat mikroorganisme, media biakan yang dipakai, dan
faktor-faktor lingkungan, seperti pH dan suhu. Media yang digunakan harus
mengandung senyawa-senyawa yang dapat dengan mudah difermentasikan dan
dioksidasikan oleh mikroorganisme. Glukosa sendiri merupakan senyawa
karbohidrat yang paling banyak dipakai oleh mikroorganisme dalam proses
fermentasi.
Kemampuan mikroorganisme untuk
memfermentasikan berbagai macam karbohidrat dan produk yang dihasilkan dari
fermentasi merupakan ciri-ciri yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi
mikroorganisme. Identifikasi ini berkaitan erat dengan aktivitas metabolisme
mikroorganisme dalam menggunakan dan menguraikan senyawa kompleks, seperti
pati, lemak, protein, dan asam nukleat (Lay, 1994).
Minimal ada tujuh proses fermentasi glukosa
yang berbeda-beda pada bakteri. Masing-masing proses fermentasi sendiri akan
membentuk produk akhir yang berbeda dan spesifik untuk kelompok bakteri
tertentu. Ada dua tahap fermentasi glukosa, yaitu:
- Rantai karbon dipecah dari glukosa dan dilepaskan dua pasang atom hidrogen untuk memperoleh senyawa karbon yang akan lebih mudah teroksidasi daripada glukosa.
- Senyawa yang teroksidasi dapat direduksi kembali dengan menggunakan atom hidrogen dari tahap pertama untuk membentuk produk fermentasi. Reaksi oksidasi harus seimbang dengan reaksi reduksi yang berlangsung.
Asam piruvat akan selalu dihasilkan
pada tahap pertama fermentasi glukosa (Fardiaz, 1992). Ada empat jalur
pemecahan glukosa menjadi asam piruvat, yaitu:
- Jalur Embden-Meyerhoff-Parnas (EMP) atau glikolisis
Jalur EMP merupakan
mekanisme yang paling umum digunakan bakteri, fungi, hewan, dan manusia untuk
mengubah glukosa menjadi asam piruvat (Volk dan Wheeler, 1993). Tahap pertama
adalah tahap pembentukan fruktosa difosfat. Tahap selanjutnya, fruktosa
difosfat dipecah menjadi dua molekul gliseraldehida fosfat yang dikatalis oleh
enzim aldolase, lalu diteruskan dengan reaksi dehidrogenasi gliseraldehida
fosfat yang juga termasuk reaksi oksidasi yang memproduksi ATP dan dikatalis
oleh enzim gliseraldehida fosfat dehidrogenase.
NAD (Nikotinamida
Adenin Dinukleotida) akan menangkap atom hidrogen yang dilepas untuk membentuk
NADH2. Jika NADH2 dioksidasi kembali pada tahap kedua
fermentasi sehingga atom hidrogen dapat dilepas kembali, maka proses fermentasi
dapat berlangsung terus. Pada proses fermentasi, NAD berperan sebagai pembawa
hidrogen.
Energi yang
dihasilkan pada tahap oksidasi gliseraldehida fosfat akan membentuk dua ATP.
Satu molekul glukosa dapat membentuk dua molekul gliseraldehida fosfat sehingga
seluruhnya dihasilkan empat ATP. Namun, karena dua ATP digunakan untuk mengubah
glukosa menjadi fruktosa difosfat sehingga hanya tinggal dua ATP yang dipakai
untuk pertumbuhan tiap molekul glukosa (Fardiaz, 1992). Reaksinya:
Glukosa + 2(ADP + 2NAD+ → 2 piruvat + 2 ATP +
+ Pi) 2 (NADH + H+)
- Jalur Entner Doudoroff (ED)
Pada jalur ED, akan
dihasilkan senyawa antara unik, yaitu 2-keto-3-deoksi-6-fosfoglukonat (KDFG).
Senyawa ini kemudian dipecah menjadi dua triosa, yaitu piruvat dan
gliseraldehida-3-fosfat oleh enzim aldolase. Selanjutnya, kedua triosa ini memasuki
jalur EMP untuk menghasilkan molekul piruvat kedua dengan cara melepas dua mol
ATP, satu mol NADH, dan H+ (Fardiaz, 1992). Reaksinya:
Glukosa + NADP+
+ NAD+ + → 2 piruvat + NADP + H+ +
(ADP+Pi) NADH + H+ + ATP
- Jalur Heksosamonofosfat (HMF)
Jalur yang dapat
ditemui pada berbagai macam organisme ini berperan penting di dalam metabolisme
mikroorganisme agar dapat membentuk pentosa yang dibutuhkan untuk melakukan
sintesis asam nukleat, asam amino aromatik, vitamin, dan sumber NADP+H+
untuk reaksi biosintesis. Jalur HMF disebut juga dengan siklus pentosa karena
energi tidak diperoleh secara langsung, tetapi NADP + H+ yang dihasilkan
ketika dimasukkan ke dalam sistem transpor elektron akan menjadi sumber energi
potensial. Enzim yang digunakan di dalam jalur ini adalah transaldolase dan
transketolase (Fardiaz, 1992). Reaksinya:
Glukosa + 12 NADP+
+ ATP →
6 CO2 + 12 (NADPH + H+) + ADP + Pi
- Jalur Fosfoketolase (FK)
Jalur ini hanya dapat ditemui pada kelompok bakteri laktobasili
heterofermentatif. Jalur FK merupakan cabang dari jalur HMF karena bakteri jenis
ini tidak memiliki enzim aldolase yang digunakan untuk memecah fruktosa
1,6-difosfat menjadi dua triosa-fosfat dan juga tidak memiliki enzim
transaldolase dan transketolase yang berperan penting di dalam jalur HMF.
Ketika asetil-fosfat diubah menjadi asetat, maka akan dihasilkan 2 ATP yang
memiliki ikatan energi tinggi. Reaksinya:
Glukosa + NAD+
+ 2 NADP+ + → piruvat + asetat + CO2 + NADH
2 ADP + P + H + + 2 NADPH + H+
+ 2 ATP
Namun jika
asetil-fosfat diubah menjadi etanol, maka ikatan energinya akan hilang sehingga
hanya dihasilkan satu mol ATP per mol glukosa (Fardiaz, 1992). Reaksinya:
Glukosa + NAD+
+ ADP + Pi → piruvat + asetat + CO2 +
NADH + H + + ATP
Pada tahap kedua fermentasi, asam
piruvat dipecah menjadi hasil produk akhir yang spesifik untuk digunakan dalam
berbagai proses fermentasi dengan memakai atom hidrogen yang dihasilkan dari
tahap pertama fermentasi. Produk akhir ini dihasilkan dari reaksi yang
dikatalis oleh enzim-enzim tertentu. Contohnya, glukosa yang difermentasi oleh
khamir melalui jalur EMP sehingga menghasilkan alkohol dan CO2.
Glukosa dapat difermentasi menjadi
alkohol maupun asam laktat. Pada fermentasi alkohol, terjadi regenerasi NAD+
sehingga enzim mengubah piruvat menjadi asetaldehida yang berperan sebagai
penerima hidrogen dan CO2. NADH kemudian membawa elektron dan ion H+
ke dua molekul asetaldehida sehingga dihasilkan produk akhir berupa alkohol
(Fardiaz, 1992). Reaksinya:
Glukosa → 2 Etanol + 2 CO2
Sedangkan pada fermentasi asam laktat,
terjadi regenerasi NAD+. Dua NADH membawa elektron dan ion H+
ke 2 molekul piruvat yang berperan sebagai penerima hidrogen sehingga
dihasilkan asam laktat sebagai produk akhirnya. Reaksinya:
Glukosa → 2 Asam laktat
Fermentasi di atas disebut juga dengan
fermentasi homolaktat karena hanya dihasilkan asam laktat sebagai satu-satunya
hasil fermentasi. Bakteri yang melakukan fermentasi ini disebut bakteri asam
laktat homofermentatif, contohnya Streptococcus, Pediococcus. Ada juga bakteri asam
laktat heterofermentatif yang tidak hanya membentuk asam laktat, tapi juga
senyawa-senyawa lainnya, seperti etanol, asam asetat, dan CO2.
Contoh bakteri ini adalah Leuconostoc, Lactobacillus (Fardiaz, 1992).
Reaksinya:
Glukosa → Asam laktat +
etanol/asam asetat + CO2
Untuk menguji adanya proses
fermentasi, dapat dilihat dari pembentukan asam dan gas. Adanya gas dapat
dilihat dengan menggunakan tabung durham atau tabung smith. Tabung smith
dipakai jika harus menentukan jumlah dan jenis gas sedangkan tabung durham
dipakai jika jenis dan jumlah gas tidak perlu diketahui. Bila ada gas, maka gas
tersebut akan masuk ke dalam tabung dan tampak sebagai gelembung udara yang
terperangkap di dalam tabung sehingga mendorong cairan yang ada di tabung
durham.
Media yang digunakan mengandung
karbohidrat berupa glukosa, manitol, laktosa, sukrosa, atau maltosa serta
ekstrak sapi dan pepton sebagai sumber nitrogen, mineral, dan vitamin. Asam
yang terbentuk dapat diketahui dengan menambahkan indikator ke dalam media yang
digunakan. Jika pada proses fermentasi bakteri ditumbuhkan pada media yang
mengandung glukosa, maka akan terbentuk asam sebagai produk fermentasi yang
ditandai dengan perubahan warna menjadi kuning yang dapat dilihat pada gambar
2.1. Asam ini akan menurunkan pH media. Indikator yang umumnya dipakai adalah
merah fenol yang berwarna merah atau BCP(Brom
Crescol Purple) yang berwarna ungu pada pH>7 (Lay, 1994).
2.1.2 Fermentasi
Asam Amino
Asam amino hanya dapat difermentasi
oleh beberapa bakteri tertentu, terutama Clostridia.
Protein awalnya akan dipecah menjadi asam amino, selanjutnya asam amino
difermentasi menjadi senyawa lain berupa asam. Asam amino yang dihasilkan dapat
sepasang ataupun satu asam amino saja. Pada fermentasi sepasang asam amino,
satu asam amino akan menjadi oksidan sedangkan satunya lagi akan menjadi
reduktan (Fardiaz, 1992). Jalur fermentasi sendiri dapat dilihat pada gambar
2.2. Reaksi fermentasi asam amino:
3 Alanin + 2 H2O
→ 2 asam propionat + asam asetat + CO2 + 3 NH3
Bakteri-bakteri yang biasanya berperan
dalam proses fermentasi adalah bakteri asam laktat, contohnya Streptococcus thermophilus yang berguna dalam
industri susu, Pediococcus cerevisiae
berperan dalam fermentasi sayuran dan daging, Leuconostoc mesentroides dipakai dalam fermentasi sayuran, dan Lactobacillus lactis penting dalam
industri susu dan sayuran; bakteri asam asetat, contohnya Acetobacter aceti yang dipakai dalam industri cuka; khamir,
contohnya Saccharomyces cerevisiae
dalam industri bir, anggur, roti; kapang, contohnya Aspergillus oryzae untuk membuat minuman beralkohol dan Aspergillus wentii digunakan dalam
fermentasi kecap, tauco, sake (Buckle et
al., 1987).
2.2
Jenis Bakteri Berdasarkan Sifat Pertumbuhannya
pada Makanan
2.2.1 Bakteri Asam Laktat
Bakteri asam laktat bergram positif,
berbentuk batang atau bulat, dan dapat memfermentasikan gula menjadi asam
laktat yang sering digunakan dalam proses fermentasi sayur-sayuran (pikel, sauerkraut), fermentasi susu (yogurt,
keju, susu asam), dan fermentasi ikan. Bakteri asam laktat menghasilkan asam
secara cepat sehingga dapat menurunkan pH lingkungan dan mencegah pertumbuhan
mikroorganisme lain yang tidak diinginkan. Contoh bakteri asam laktat adalah
beberapa Lactobacillus, Streptococcus, dan Pediococcus yang bersifat homofermentatif serta Leuconostoc dan beberapa Lactobacillus yang bersifat
heterofermentatif (Fardiaz, 1992).
2.2.2
Bakteri Asam Asetat
Bakteri asam asetat berbentuk batang,
bergram negatif, contohnya Gluconobacter
dan Acetobacter yang dapat
mengoksidasi alkohol menjadi asam asetat. Asam asetat dapat dioksidasi lebih
lanjut menjadi CO2 oleh bakteri Acetobacter.
Spesies yang sering dipakai dalam
industri cuka adalah A. Aceti dan G. Suboxydans (Fardiaz, 1992).
2.2.3
Bakteri Proteolitik
Bakteri ini akan menghasilkan enzim
proteinase ekstraseluler yang merupakan enzim pemecah protein yang dibentuk di
dalam sel dan dikeluarkan dari sel setelah enzim selesai bekerja. Enzim
proteinase terdapat pada semua bakteri, tetapi tidak semua bakteri memiliki
enzim proteinase ekstraseluler. Ada tiga macam bakteri proteolitik, yaitu:
- Bakteri aerobik atau anaerobik fakultatif yang tidak membentuk spora, contohnya Proteus dan Pseudomonas.
- Bakteri aerobik dan anerobik fakultatif pembentuk spora, contohnya Bacillus.
- Bakteri anaerobik pembentuk spora, contohnya beberapa Clostridium.
Ada bakteri yang bersifat proteolitik
asam yang dapat menghidrolisis protein dan memfermentasi asam, contohnya Streptococcus faecalis dan ada juga
bakteri yang bersifat putrefaktif yang memecah protein secara anaerobik dan
menghasilkan senyawa berbau busuk, contohnya Pseudomonas (Fardiaz, 1992).
2.2.4
Bakteri Lipolitik
Bakteri ini menghasilkan enzim lipase
yang berfungsi sebagai katalis reaksi hidrolisis lemak menjadi asam-asam lemak
dan gliserol. Produk akhir dari hidrolisis lemak dapat dioksidasi lagi menjadi
energi di dalam kondisi aerob. Kebanyakan bakteri aerobik dan proteolitik aktif
juga merupakan bakteri lipolitik. Contoh bakteri lipolitik adalah Pseudomonas, Alcaligenes, Serratia,
dan Micrococcus (Fardiaz, 1992).
2.2.5
Bakteri Sakarolitik
Bakteri ini memecah disakarida dan
polisakarida menjadi gula-gula sederhana. Hanya sedikit bakteri amilolitik yang
dapat menghasilkan enzim amilase dan menghidrolisis pati di luar sel, contohnya
Bacillus subtilis dan Clostridium butyricum. Ada juga bakteri
yang dapat memecah selulosa (Fardiaz, 1992).
2.2.6
Bakteri Pektolitik
Pektin merupakan karbohidrat kompleks
yang dapat ditemui pada buah dan sayuran. Pektinase (campuran enzim pektolitik)
dapat digunakan untuk memecah pektin dan mengakibatkan busuk lunak atau busuk
air pada buah dan sayur serta hilangnya kemampuan memproduksi gel pada sari
buah. Contoh bakteri pektolitik adalah Erwinia, Bacillus, dan Clostridium (Fardiaz, 1992).
2.2.7
Bakteri Osmofilik
Bakteri osmofilik atau sakarofilik
dapat ditemui pada media yang memiliki kandungan gula tinggi, namun sebenarnya
bakteri osmofilik hanya bersifat osmotoleran sehingga masih dapat tumbuh dengan
atau tanpa kandungan gula yang tinggi, contohnya Leuconostoc (Fardiaz, 1992).
2.3
Produk-Produk Pangan Hasil Fermentasi
Produk pangan adalah media yang baik bagi
pertumbuhan mikroorganisme. Fermentasi sendiri merupakan perubahan kimiawi yang
terjadi pada bahan pangan yang disebabkan oleh enzim. Sifat produk pangan hasil
fermentasi sangat dipengaruhi oleh mutu dan sifat asli produk pangan itu
sendiri. Fermentasi dari mikroorganisme yang diinginkan akan memberikan bentuk,
rasa, dan tekstur yang bagus.
2.3.1
Sayuran
Bakteri asam laktat dapat
memfermentasi hampir semua jenis sayuran dan buah-buahan yang menyerupai
sayuran, seperti tomat, mentimum, dan olive. Sayuran dan buah mengandung gula
yang tinggi dan bergizi untuk pertumbuhan bakteri asam laktat. Faktor-faktor
lingkungan yang akan mempengaruhi proses fermentasi sayuran adalah:
- Kondiri anaerobik.
- Kadar garam yang dapat digunakan untuk menyerap cairan dan zat-zat gizi dari produk.
- Suhu yang sesuai untuk proses fermentasi.
- Tersedianya bakteri asam laktat yang diperlukan.
Pada fermentasi sayuran akan terjadi
perubahan-perubahan kompleks yang ditimbulkan dari pertumbuhan serangkaian
bakteri asam laktat, contohnya fermentasi ini akan dimulai oleh Leuconostoc mesenteroides dan
dilanjutkan oleh Lactobacillus
(Buckle et al., 1987).
2.3.2 Sauerkraut (Sayur Asin)
Sauerkraut merupakan kobis
asam. Kobis dibersihkan, dicuci, dan diiris kecil-kecil selebar 1 m, lalu
irisan kubis dimasukkan ke dalam tangki dan ditambahkan garam untuk menyerap
cairan dari irisan kobis, kemudian diaduk serata mungkin. Selanjutnya, tangki
ditutup dengan plastik dan air dimasukkan ke dalam plastik sebagai pemberat dan
penutup sehingga irisan kobis akan terendam. Tidak tercelupnya kobis di dalam
larutan garam akan menyebabkan pertumbuhan khamir dan kapang sehingga
mengakibatkan rasa yang tidak dikehendaki.
Garam menarik air dan zat gizi dari
jaringan sayuran sehingga zat gizi tersebut akan melengkapi substrat yang
digunakan untuk pertumbuhan bakteri asam laktat. Garam dan asam yang diproduksi
dari fermentasi dapat mencegah pertumbuhan mikroorganisme yang tidak
dikehendaki dan memperlambat pelunakan jaringan kobis. Kandungan garamnya harus
cukup agar dapat menumbuhkan bakteri asam laktat dan dapat menghasilkan kraut
yang seimbang dengan garamnya.
Fermentasi dimulai oleh bakteri Leuconostoc mesenteroides dan
dilanjutkan oleh Lactobacillus sp.
yang lebih tahan terhadap asam. Suhu berpengaruh besar terhadap kecepatan
fermentasi, mutu produk pangan, dan perkembangan jenis mikroorganisme. Suhu
antara 25-300C adalah suhu optimal untuk fermentasi dan mutu produk
pangan yang sempurna dan dapat terjadi dalam waktu 2-3 minggu. Suhu di atas 300C
akan memungkinkan pertumbuhan bakteri homofermentatif dan menghasilkan produk
yang terlalu asam serta flavornya kurang sedangkan suhu di bawah 250C
akan meningkatkan keseluruhan waktu yang diperlukan untuk fermentasi dan dapat
mencapai waktu satu tahun (Buckle et al.,
1987).
2.3.3
Miso (Air Tajin)
Miso merupakan hasil fermentasi beras
atau kedelai. Bahan ini digunakan untuk membuat sup dan memberi tambahan rasa
pada produk pangan. Tahap pertama fermentasi aeobik dilakukan oleh Aspergillus oryzae dan tahap fermentasi
kedua oleh Saccharomyces rouxii secara anaerobik.
Untuk membuat miso, pertama beras
dicuci, direndam, dan direbus, kemudian diinokulasi dengan Aspergillus oryzae sehingga terjadi proses fermentasi pada suhu 400C.
Beras harus dalam kondisi basah untuk pertumbuhan kapang, namun harus cukup
kering untuk menghambat pertumbuhan bakteri lainnya. Pertumbuhan miselia kapang
harus dihentikan sebelum terjadi pembentukan spora. Beras yang telah berkapang disebut juga
dengan koji yang merupakan kultur stater untuk fermentasi.
Selanjutnya, kedelai dicuci, direndam,
dan direbus, kemudian didinginkan. Bahan ini dihancurkan bersama garam dengan
perbandingan 4 bagian koji, 10 bagian kedelai, 2 bagian garam, dan 1 bagian
miso lama serta air. Campuran ini difermentasi pada suhu 280C selama
seminggu secara aerobik, lalu dimasukkan ke dalam tong untuk memulai fermentasi
kedua pada kondisi anaerobik. Fermentasi kedua akan menggunakan khamir pada
suhu 350C selama 2 bulan. Setelah itu, campuran dimatangkan pada
suhu kamar untuk beberapa minggu. Produk akhir kemudian dihaluskan menjadi
adonan atau tepung basah untuk dipakai pada campuran bahan pangan lainnya. Pada
fermentasi ini, akan ikut berperan bakteri-bakteri asam laktat (Buckle et al., 1987).
2.3.4
Air Rendaman Tahu
Dalam fermentasi tahu, pertama kacang
kedelai direndam di dalam air dan didedak hingga menjadi suatu campuran.
Campuran ini kemudian disaring dan diambil filtratnya, yaitu susu kedelai. Selanjutnya,
susu kedelai diberi garam, seperti magnesium klorida atau kalsium sulfat agar dapat
menggumpal. Setelah cukup lunak, gumpalan ini di-press menjadi potongan tahu. Bakteri yang umumnya berperan dalam fermentasi tahu adalah
Bacillus cereus (Ewald, 1997).
2.4
Pemecahan Makanan oleh Mikroorganisme
Mikroorganisme menggunakan zat-zat
hara untuk dapat melakukan sintesis sel dan memperoleh energi (Fardiaz, 1992). Zat-zat
hara ini biasanya berupa molekul besar, seperti karbohidrat, protein, lemak,
dan asam nukleat (Lay, 1994). Karbohidrat dan protein merupakan sumber energi
untuk dapat menghasilkan ATP sedangkan asam amino dari protein, purin dan
pirimidian dari asam nukleat, vitamin, serta mineral sebagai faktor-faktor
pertumbuhan. Zat-zat lainnya yang diperlukan mikroorganisme adalah unsur-unsur
makro, seperti C, O, N, H, P, dan S serta unsur-unsur mikro, yaitu Ca, K, Mg,
Fe, Mn, Cl, Cu (Fardiaz, 1992).
Agar dapat digunakan oleh sel, maka
makromolekul harus dihidrolisis terlebih dahulu. Hidrolisis sendiri merupakan
proses penguraian molekul dengan menambahkan air. Mikroorganisme dapat
menghasilkan enzim (eksoenzim) yang dapat mengkatalis pemecahan makanan menjadi
molekul-molekul sederhana. Molekul kecil ini akan dibawa ke sitoplasma untuk
dipakai sebagai sumber energi dan senyawa awal dalam sintesis sel (Lay, 1994).
Umumnya makanan mengandung karbohidrat
mulai dari monosakarida sampai polisakarida, tetapi tidak semua mikroorganisme
dapat menghidrolisis karbohidrat, terutama pati. Hanya mikroorganisme yang
bersifat amilolitik saja yang dapat memecah pati sedangkan monosakarida dan
disakarida dapat dengan mudah dipecah oleh mikroorganisme.
Pada buah-buahan yang banyak mengandung
monosakarida, sering terjadi fermentasi spontan yang menghasilkan asam dan gas
sedangkan pada susu yang banyak mengandung disakarida (laktosa), sering terjadi
fermentasi asam laktat. Asam yang dihasilkan mikroorganisme sering ditemui pada
makanan yang banyak mengandung karbohidrat, namun kapang dan khamir biasanya
tidak menghasilkan asam.
Perubahan biokimia juga terjadi pada
makanan yang banyak mengandung protein, namun karena molekul protein lebih
kompleks daripada karbohidrat sehingga hanya mikroorganisme yang memiliki
sistem enzim yang kompleks saja yang dapat memecah protein, yaitu mikroorganisme
proteolitik. Protein akan dipecah menjadi asam amino yang dapat dipakai sebagai
sumber energi sel. Selain asam amino, pemecahan protein juga akan menghasilkan
gas, asam, dan produk-produk akhir lainnya yang tidak diinginkan, seperti bau
busuk.
Makanan juga banyak mengandung lemak
yang bermacam-macam komposisinya. Komponen penyusun lemak adalah asam-asam
lemak dan gliserol. Asam-asam lemak berantai pendek lebih mudah dipecah
dibandingkan asam-asam lemak berantai panjang. Asam lemak berantai pendek dapat
ditemui pada lemak hewani sedangkan asam lemak berantai panjang banyak terdapat
pada minyak nabati. Lemak lebih sulit dipecah daripada karbohidrat dan protein.
Pemecahan lemak kadang-kadang merugikan karena menyebabkan bau tengik dan tidak
dikehendaki pada pematangan keju (Fardiaz, 1992).
2.4.1
Pemecahan Karbohidrat
Karbohidrat terdiri dari atom-atom C,
H, dan O. Karbohidrat dapat dibagi menjadi lima macam, yaitu monosakarida
(glukosa, fruktosa, galaktosa) yang tersusun dari aldehid dan keton dari
alkohol polihidrat, disakarida yang tersusun dari dua monosakarida (laktosa,
maltosa, sukrosa, selobiase), trisakarida (rafinose), oligosakarida (dekstrin,
tetrasakarida), dan polisakarida (pati, glikogen, selulosa).
Karena karbohidrat lebih mudah
dipecah, maka makanan yang banyak mengandung karbohidrat lebih mudah diserang
oleh mikroorganisme. Karbohidrat akan dipecah menjadi asam, gas, dan
produk-produk lainnya. Pemecahan gula bersifat spesifik untuk mikroorganisme
tertentu, contohnya glukosa, laktosa, dan sukrosa akan dipecah menjadi asam dan
gas oleh bakteri Enterobacter aerogenes,
Staphylococcuc aureus akan memecah
gula-gula tersebut menjadi asam, sedangkan bakteri Alcaligenes faecalis tidak akan menghasilkan asam dan gas.
Pati dapat digunakan oleh bakteri
tertentu untuk menghasilkan energi dan komponen gum agar dapat melindungi sel
dari pembentukan asam berlebih yang dapat mengakibatkan pembusukkan makanan,
contohnya kerusakan roti yang disebut juga roti berlendir karena ketika pati
dan protein pada roti dipecah, terbentuk bau dan tekstur yang berbeda dari roti
yang masih berkualitas bagus.
Asam laktat adalah asam yang paling
banyak dihasilkan dalam proses fermentasi makanan, contohnya fermentasi sayur
asin dan susu. Konsentrasi asam yang dihasilkan sangat tinggi sehingga dapat
mencegah pertumbuhan mikroorganisme yang memproduksinya maupun bakteri yang
tahan asam. Pertumbuhan bakteri akan terhambat apabila asam yang dihasilkan
mencapai pH 3-4,3. Jenis mikroorganisme, kandungan gula, dan jenis makanan akan
mempengaruhi produksi asam yang dihasilkan.
Produk-produk yang dihasilkan dari
pemecahan gula akan dipengaruhi oleh jenis organisme. Enzim-enzim yang ada di
sel mikroorganisme akan memecah komponen karbohidrat kompleks menjadi lebih
sederhana, yaitu:
Sukrosa −─invertase→
glukosa + fruktosa
Maltosa
−─maltase→ glukosa + glukosa
Laktosa −─β-galaktosidase→
glukosa + galaktosa
Karena pati merupakan karbohidrat
kompleks yang sulit untuk dipecah, maka pembentukan asam dari pati lebih lama
dibandingkan pembentukan asam dari karohidrat lainnya karena pati harus dipecah
terlebih dahulu menjadi glukosa oleh enzim amilase yang hanya dihasilkan
mikroorganisme amilolitik (Fardiaz, 1992). Enzim amilase terdiri dari β–amilase
dan α–amilase yang memiliki kemampuan menghidrolisis lebih kuat daripada
β-amilase (Winarno, 1995). Aktivitas enzim amilase akan mempengaruhi jumlah
asam dan gula yang dihasilkan dari pati (Fardiaz, 1992).
Yodium akan bereaksi secara kimiawi
dengan pati dan masuk ke dalam bagian pati yang kosong dan berbentuk spiral
sehingga terbentuk warna biru-kehitaman. Proses yodinisasi ini akan membentuk
molekul yang dapat menyerap semua cahaya, kecuali warna biru. Jika pati telah
dipecah menjadi maltosa atau glukosa, maka warna birunya akan hilang karena
bentuk spiralnya sudah tidak ada. Tidak terbentuknya warna pada saat larutan
yodium ditambahkan ke dalam media menunjukkan terjadinya hidrolisis pati.
Pada media yang mengandung pati, maka
pati di sekitar pertumbuhan bakteri akan dihidrolisis oleh enzim amilase yang
dihasilkan bakteri. Jika zat pati dihidrolisis, maka pada media agar yang
diteteskan larutan yodium akan timbul daerah transparan di sekitar pertumbuhan
bakteri yang ditunjukkan pada gambar 2.3. Sebaliknya, jika pati tidak
dihidrolisis, maka akan timbul warna biru-kehitaman di sekitar pertumbuhan
(Lay, 1994).
Media yang biasa digunakan pada uji
hidrolisis karbohidrat adalah media Starch
Agar (SA) yang mengandung
tripton, ekstrak khamir, K2HPO4, pati terlarut, agar, dan
air. Ekstrak khamir sebagai sumber vitamin B kompleks, tripton dipakai untuk
menyediakan nitrogen, karbohidrat, dan garam mineral, air untuk menyalurkan
nutrient yang dibutuhkan mikroba, sedangkan pati berfungsi sebagai komponen
karbohidrat yang akan dihidrolisis pada uji ini (Fardiaz, 1992).
2.4.2 Pemecahan Protein
Komponen utama protein
adalah asam amino yang terdiri dari unsur C, O, N, dan H. Ada tiga macam
protein yaitu protein sederhana (albumin, globulin, gultelin, prolamin, dan
albuminioid), protein terkonjugasi (glikoprotein, fosfoprotein, nukleoprotein),
dan turunan protein (protein terkoagulasi, metaprotein, pepton, peptide).
Contoh-contoh makanan yang mengandung protein adalah telur, daging, susu,
serelia, dan kacang-kacangan.
Pemecahan protein lebih
kompleks dibandingkan pemecahan karbohidrat. Produk akhir yang dihasilkan juga
lebih bervariasi karena protein memiliki struktur yang lebih kompleks. Oleh
karena itu, hanya mikroorganisme yang memiliki sistem enzim yang kompleks saja
yang dapat mendekomposisi protein menjadi senyawa-senyawa sederhana, yaitu:
Protein → proteosa → pepton →
polipeptida →
peptida → asam amino → NH3
dan N
Produk akhir dan senyawa
antara yang terbentuk sangat bervariasi. Pemecahan protein juga akan
menghasilkan alkohol, beberapa gas, seperti CO2, hidrogen, metana,
amonia, dan komponen-komponen yang berbau busuk, seperti indol, skatol,
hidrogen sulfida, kadaverin.
Dekomposisi protein oleh
mikroorganisme disebut juga dengan proses putrefaksi (Fardiaz, 1992) yang menggunakan
enzim protease untuk menghidrolisis ikatan peptida di protein dan melepas asam
amino (Volk dan Wheeler, 1993). Selain terjadi pemecahan asam amino, pada
proses ini juga akan dihasilkan komponen-komponen sederhana yang berbau busuk,
contohnya Clostridium memecah protein
menjadi senyawa-senyawa sulfur berbau busuk secara anaerobik. Pemecahan protein
secara anaerobik menghasilkan produk akhir yang lebih stabil sehingga berbau
busuk dan menyengat. Sebaliknya, pemecahan protein yang terdiri dari asam-asam
amino sulfur secara aerobik tidak akan menyebabkan bau busuk karena produk
akhirnya lebih stabil dan dioksidasi secara sempurna.
Walaupun dekomposisi
protein sering mengakibatkan bau busuk, namun pemecahan protein tetap merupakan
tahap yang penting dan dikehendaki dalam beberapa proses pengolahan pangan,
terutama pengembangan daging dan pengolahan keju. Di dalam proses tersebut, akan
terjadi hidrolisis atau denaturasi protein agar dapat mengempukkan protein
daging dan mengumpulkan protein susu (Fardiaz, 1992).
Pada hidrolisis protein,
jika susu yang mengandung kasein dicampur dengan media, maka akan timbul warna
keruh pada media akibat reaksi kasein dengan ion Ca2+ sehingga
membentuk Ca-kasein. Kompleks Ca-kasein tidak dapat larut di dalam media
sehingga kompleks ini akan membentuk larutan koloidal yang menyebabkan media
menjadi keruh.
Jika mikroorganisme
memproduksi enzim kaseinase yang dapat menghidrolisis kasein, maka daerah di
sekitar koloni bakteri akan berwarna jernih yang dapat dilihat pada gambar 2.4.
Kejernihan ini akibat penguraian molekul kasein menjadi asam amino yang larut
di dalam media sehingga kekeruhan di sekitar koloni bakteri menjadi hilang.
Enzim yang digunakan untuk menghidrolisis protein disebut juga enzim proteinase
(Lay, 1994).
Media untuk uji hidrolisis
protein adalah media SMA (Skim Milk Agar)
yang tersusun dari tripton, dekstrosa, ekstrak khamir, agar, air destilata, dan
20% susu skim bubuk. Biasanya media ini dapat bekerja pada pH netral, yaitu pH
7. Tripton sebagai sumber sumber N dan mineral, ekstrak khamir sebagai sumber
vitamin B kompleks, dekstrosa sebagai sumber energi, sedangkan susu skim bubuk
mengandung kasein yang akan dipecah pada uji hidrolisis ini (Fardiaz, 1992).
2.4.3 Pemecahan Lemak
Lemak yang terdiri dari
asam-asam lemak dan gliserol merupakan komponen pangan yang sering ditemui pada
tanaman dan hewan. Jenis asam-asam lemaknya akan mempengaruhi sifat lemak. Asam
lemak yang terdiri dari ikatan rangkap dan tidak memiliki jumlah atom H
maksimum disebut asam lemak tidak jenuh yang mudah dipecah oleh mikroorganisme
dan banyak ditemukan pada minyak tumbuhan sedangkan asam lemak yang mempunyai
jumlah atom H maksimum disebut asam lemak jenuh dan banyak ditemui pada minyak
hewani.
Jika asam-asam lemak
berantai pendek (asam butirat) dihidrolisis, maka akan timbul bau yang
menyengat. Sebaliknya, asam-asam lemak berantai panjang (asam oleat dan
palmitat) bila dihidrolisis tidak akan menyebabkan bau yang menyengat karena asam
lemak berantai panjang dan jenuh memiliki titik cair yang lebih tinggi daripada
asam lemak tidak jenuh berantai pendek.
Lemak lebih sulit dipecah
oleh mikrooganisme daripada karbohidrat dan protein sehingga hanya
mikrooganisme lipolitik yang menghasilkan enzim lipase saja yang dapat memecah
lemak menjadi asam-asam lemak bebas dan gliserol dengan bantuan air (Fardiaz, 1992),
selanjutnya gliserol dimetabolisasi melalui jalur EMP dan asam lemaknya
diuraikan melalui asetat pada siklus asam sitrat (Volk dan Wheeler, 1993). Reaksi
hidrolisis ini akan dipercepat lagi dengan adanya asam, basa, dan enzim-enzim
(Winarno, 1995). Kapang dapat menghasilkan enzim lipase dalam jumlah yang
banyak sehingga sering menyerang makanan yang kaya akan lemak dan menyebabkan
bau tengik (Fardiaz, 1992).
Jika lemak di dalam media
dihidrolisis oleh enzim lipase, maka daerah di sekitar koloni bakteri menjadi
asam akibat terbentuknya asam lemak. Indikator pH yang ditambahkan ke dalam
media akan membantu menunjukkan adanya proses hidrolisis yang ditandai dengan
perubahan warna yang dintujukkan pada gambar 2.5. Indikator pH yang dipakai
akan mempengaruhi perubahan warna (Lay, 1994).
Media NA (Nutrient Agar) merupakan media yang
dipakai untuk hidrolisis lemak. Agar dapat digunakan untuk menguji adanya
mikroba lipolitik, maka pada media ini ditambahkan lemak 1%. Komponen-komponen
media ini adalah ekstrak sapi sebagai zat hara untuk menyediakan karbohidrat,
nitrogen, vitamin, dan garam mineral, pepton untuk mengontrol pH, agar, air
untuk transportasi nutrient yang dibutuhkan bagi pertumbuhan mikroba, dan merah
netral sebagai indikator (Fardiaz, 1992).
2.5 Uji Katalase
Menurut Lay (1994), katalase merupakan
enzim yang digunakan untuk mengkatalis reaksi penguraian H2O2
(hidrogen peroksida) menjadi H2O dan O2. Hidrogen
peroksida yang dihasilkan dari metabolisme aerob ini bersifat toksik terhadap
sel karena dapat menginaktivasi enzim yang ada di dalam sel. Oleh karena itu,
senyawa toksik ini harus diuraikan oleh mikroorganisme yang hidup di lingkungan
aerob dengan menggunakan enzim katalase. Enzim peroksidase juga dapat digunakan
untuk menguraikan H2O2, namun tidak akan terbentuk O2
pada penguraian ini.
Uji katalase dapat digunakan untuk
mengidentifikasi kelompok bakteri tertentu, contohnya uji katalase dipakai
untuk membedakan Staphylococcus dan Streptococcus pada kelompok bakteri kokus
karena kelompok bakteri Staphylococcus
bersifat katalase positif sedangkan Streptococcus
bersifat katalase negatif.
Uji katalase dapat dilakukan dengan
menggunakan larutan H2O2 3% pada koloni yang terpisah.
Jika bakteri bersifat katalase positif, maka akan timbul gelembung udara di
sekitar koloni. Reaksi yang dikatalisasi oleh enzim katalase adalah sebagai
berikut:
H2O2 →
H2O + ½ O2
katalase gelembung udara
2.6 Pewarnaan
Gram
Menurut Lay (1994), pewarnaan Gram
biasanya digunakan untuk membedakan bakteri Gram positif dan bakteri Gram
negatif. Biakan yang dipakai hendaknya yang masih segar dan berumur 24-48 jam
sehingga dapat memberikan hasil yang baik dan tepat. Pada saat kultur bakteri
diberi kristal violet sebagai pewarna primer, maka baik bakteri Gram positif
dan negatif akan sama-sama berwarna ungu.
Tahap selanjutnya adalah pemberian
larutan lugol sebagai mordan yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas
pengikatan zat warna oleh bakteri sehingga pengikatannya menjadi lebih kuat. Kristal
violet dan lugol akan membentuk kompleks yang berwarna ungu. Setelah
ditambahkan larutan mordan, zat warna akan lebih jelas dan sulit untuk
dilarutkan.
Ketika bakteri diberi larutan pemucat
(aseton alkohol), maka bakteri Gram negatif menjadi tidak berwarna karena
lipidnya larut di dalam larutan pemucat sehingga pori-pori dinding sel menjadi
besar dan kompleks kristal violet-yodium dapat lepas sedangkan bakteri Gram
positif tetap berwarna ungu karena kompleks kristal violet-yodium dapat
dipertahankan dan tetap melekat pada dinding sel.
Penambahan safranin sebagai zat warna
sekunder mengakibatkan bakteri Gram negatif menjadi berwarna merah karena
kompleks kristal violet-yodium telah larut dan dinding selnya mengikat safranin
sedangkan bakteri Gram postif tetap berwarna ungu karena dinding selnya sudah
mengikat kristal violet sehingga tidak bisa mengikat safranin lagi. Fungsi
safranin adalah sebagai zat warna pembeda terhadap pewarna primer.
Adanya perbedaan pada tahap perwarnaan
Gram disebabkan perbedaan struktur dinding sel yang dimiliki bakteri Gram
positif dan negatif. Sebagian besar dinding sel bakteri Gram positif tersusun
dari peptidoglikan sedangkan komponen utama dinding sel bakteri Gram negatif
adalah lipid yang dapat larut di dalam alkohol dan aseton sehingga dinding
selnya menjadi besar dan kompleks kristal violet-yodium dapat keluar.
2.7 Bacillus cereus
Menurut Fardiaz (1992), Bacillus cereus termasuk bakteri pembentuk
spora yang berbentuk silinder dan tidak membengkak. Bakteri ini berkatalase positif, bergram positif, aerob sampai
anaerob fakultatif, dan sering menghasilkan asam tanpa gas yang sering
merusak makanan kaleng. Spesies ini juga bersifat proteolitik yang dapat
menghasilkan enzim proteinase yang digunakan untuk memecah protein menjadi
polipeptida dan asam amino. Enzim yang diproduksi ini menyerupai rennin
sehingga sering mengumpalkan susu. Bakteri ini juga termasuk bakteri lipolitik
yang dapat memecah lemak menjadi asam lemak dan gliserol. Bakteri Bacillus cereus.
2.8 Fusarium moniliforme
Kapang ini banyak ditemui pada makanan dan
sulit untuk dikenali karena penampakan pertumbuhannya yang bervariasi. Ciri
utama dari Fusarium sp. adalah adanya
makrokonidia yang berbentuk pedang, multisel, dan berwarna. Kadang-kadang juga
terdapat mikrokonidia yang berbentuk oval. Biasanya kapang ini menghasilkan
enzim hidrolitik, seperti amilase, lipase, dan proteinase yang dapat digunakan
untuk memecah makromolekul menjadi komponen yang lebih sederhana sehingga Fusarium sp. dapat dtumbuh pada media
yang mengandung pati, lipid, pektin, dan protein.
Kapang ini dapat memproduksi asam
giberelat yang dapat digunakan untuk memproduksi benih dan mengganti hormon
pertumbuhan. Selain itu, Fusarium sp.
sering dipakai dalam fermenatsi makanan, namun kelemahan fermentasi kapang
adalah adanya miselium yang dapat menganggu penampakan makanan.
Kapang ini juga dapat menghasilkan
antibiotik, enzim, dan asam. Enzim amilase dan proteinase merupakan enzim utama
dalam fermentasi makanan oleh kapang. Hidrolisis pati digunakan dalam industri
yang memakai tape, ragi, dan koji sebagai starternya, hidrolisis proein dalam
industri kecap dan tauco, sedangkan hidrolisis lemak dalam industri susu
(Fardiaz, 1992). Fusarium miniliforme.
2.9 Candida tropicalis
Khamir ini bersifat oksidatif, tetapi
bersifat fermentatif lemah atau negatif juga dan sering ditemui pada makanan
yang mengandung kadar garam dan asam dalam jumlah yang tinggi. Spesies ini dapat
membentuk film pada permukaan bahan pangan dan sering merusak produk pangan
berkadar garam dan asam tinggi. C.
tropicalis dapat memfermentasi monosakarida dan disakarida, seperti
galaktosa, glukosa, maltosa, sukrosa, laktosa, dan raffinosa, tetapi jarang
yang dapat memfermentasi pati karena jumlah enzim pemecah polisakaridanya
sangat rendah. Dari proses fermenatsi, khamir dapat menghasilkan alkohol, CO2,
dan produk-produk lain (Fardiaz, 1992). C.
tropicalis dapat dilihat pada gambar 2.8.
BAB III
METODE KERJA
3.1 Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan pada
percobaan ini adalah gelas benda, gelas penutup, jarum ose, lampu spiritus,
mikroskop, penjepit, hair dryer, hand counter, inkubator dengan suhu
30-320C, dan vortex.
Bahan-bahan yang dipakai adalah cat Gram
A yang berupa larutan cat Hucker’s
crystal violet, larutan Gram B berupa larutan mordan lugol’s iodine, larutan Gram C berupa larutan aseton-alkohol, cat Gram
D berupa larutan cat safranin, alkohol,
tabung Glucose Broth (GB) + indikator
Brom Cresol Purple (BCP) + tabung
durham, tabung Sucrose Broth (SB) +
indikator BCP + tabung durham, tabung Lactose
Broth (LB) + indikator BCP + tabung durham, cawan Starch Agar (SA), cawan Skim
Milk Agar (SMA), cawan Nutrient Agar (NA)
+ 1% lemak + neutral red, tabung dan
cawan kontrol untuk masing-masing media, larutan lugol (yodium), larutan H2O2
3%, kultur murni Candida tropicalis, Fusarium moniliforme, dan bakteri Bacillus cereus, serta sampel
erlenmeyer air sayur asin, air rendaman tahu, air asinan, dan air tajin.
3.2 Prosedur Kerja
3.2.1 Uji
Fermentasi
1. Empat tabung berisi GB + indikator BCP + tabung
durham, empat tabung berisi SB + indikator BCP + tabung durham, dan empat
tabung berisi LB + indikator BCP + tabung durham disiapkan.
2. Satu tabung dari masing-masing media diinokulasi
dengan satu ose kultur murni dari khamir Candida
tropicalis, satu tabung diinokulasi dengan satu ose kultur murni Fusarium moniliforme, satu tabung lagi
diinokulasi dengan satu ose kultur murni bakteri Bacillus cereus, dan satu tabung lainnya dengan satu ose sampel
air tajin.
3. Tabung-tabung yang telah diinokulasi tersebut
diinkubasi pada suhu 30-320C selama 2 hari.
4. Gas yang terbentuk pada tabung durham dan asam
yang terbentuk pada media yang ditandai dengan perubahan warna media dari ungu menjadi
kuning diamati dan dibandingkan dengan tabung kontrol.
3.2.2
Uji Hidrolisis Pati
- Setengah bagian cawan SA digores langsung dengan ose yang telah dipijarkan dari kultur murni Candida tropicalis sedangkan setengah bagian lagi tidak diinokulasi, satu cawan digores dengan ose dari kultur murni Fusarium moniliforme, satu cawan lagi digores dengan ose dari kultur murni bakteri Bacillus cereus, dan satu cawan lainnya digores dengan ose dari sampel air tajin.
- Cawan-cawan tersebut diinkubasi pada suhu 30-320C selama 2 hari.
- Larutan yodium diteteskan pada semua cawan SA sehingga semua bagian terendam.
- Bagian transparan (kuning) yang mengelilingi koloni yang menunjukkan adanya hidrolisis pati diamati dan dibandingkan dengan cawan kontrol.
3.2.3
Uji Hidrolisis Protein
- Setengah bagian cawan SMA digores langsung dengan ose yang telah dipijarkan dari kultur murni Candida tropicalis sedangkan setengah bagian lagi tidak diinokulasi, satu cawan digores dengan ose dari kultur murni Fusarium moniliforme, satu cawan lagi digores dengan ose dari kultur murni bakteri Bacillus cereus, dan satu cawan lainnya digores dengan ose dari sampel air tajin.
- Cawan-cawan tersebut diinkubasi pada suhu 30-320C selama 2 hari.
- Areal bening yang mengelilingi koloni mikroba proteolitik yang menunjukkan adanya hidrolisis protein diamati dan dibandingkan dengan cawan kontrol.
3.2.4
Uji Hidrolisis Lemak
- Setengah bagian cawan NA yang mengandung 1% lemak dan neutral red digores langsung dengan ose yang telah dipijarkan dari kultur murni Candida tropicalis sedangkan setengah bagian lagi tidak diinokulasi, satu cawan digores dengan ose dari kultur murni Fusarium moniliforme, satu cawan lagi digores dengan ose dari kultur murni bakteri Bacillus cereus, dan satu cawan lainnya digores dengan ose dari sampel air tajin.
- Cawan-cawan tersebut diinkubasi pada suhu 30-320C selama 2 hari.
- Warna merah yang terbentuk di bagian bawah koloni yang menunjukkan adanya hidrolisis lemak diamati dan dibandingkan dengan cawan kontrol.
3.2.5
Uji Katalase
- Air steril diteteskan di atas gelas objek, kemudian dua ose pertumbuhan kultur Candida tropicalis diambil dan diletakkan di atas air steril pada gelas objek.
- Dua tetes larutan 3% H2O2 diteteskan di atas gelas objek tersebut.
- Langkah di atas diulangi untuk kultur Fusarium moniliforme, Bacillus cereus, dan sampel air tajin.
- Gelembung-gelembung kecil oksigen yang terbentuk yang menandakan adanya enzim katalase diamati.
3.2.6
Pewarnaan Gram
- Pewarnaan Gram dilakukan pada sampel air tajin yang digunakan.
- Hasil pewarnaan tersebut diamati.
- Jumlah bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif dinyatakan kira-kira dalam persen.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1
Bakteri Bacillus cereus
Tabel 4.1 Hasil uji yang dilakukan terhadap bakteri Bacillus cereus
|
|
Pertumbuhan Bakteri
|
||
|
Uji Fermentasi
|
GB
|
gas
asam
|
-
+
|
|
LB
|
gas
asam
|
-
+
|
|
|
SB
|
gas
asam
|
-
+
|
|
|
Uji Hidrolisis Pati
|
-
|
||
|
Uji Hidrolisis Protein
|
+
|
||
|
Uji Hidrolisis Lemak
|
+
|
||
|
Uji Katalase
|
SA
|
+
|
|
|
SMA
|
-
|
||
|
NA + lemak
|
+
|
||
Fermentasi merupakan proses pemecahan
molekul-molekul, seperti karbohidrat dan asam amino tanpa membutuhkan oksigen
agar dapat memproduksi energi yang dibutuhkan bagi pertumbuhan mikroba. Proses
fermentasi sering terjadi pada komponen karbohidrat, yaitu sukrosa, laktosa, glukosa,
maltosa, dan sebagainya.
Pada uji fermentasi, media yang
digunakan harus mengandung karbohidrat agar dapat difermentasi oleh mikroba
yang ada. Dalam percobaan ini, media yang dipakai adalah Glucose Broth, Sucrose Broth,
dan Lactose Broth. Media-media ini
mengandung ekstrak sapi, pepton, air destilata, dan yang paling utama adalah
glukosa, sukrosa, dan laktosa untuk masing-masing media. Pepton dan ekstrak
sapi berperan sebagai sumber nitrogen, vitamin, dan mineral untuk pertumbuhan
mikroba (Fardiaz, 1992).
Indikator BCP yang ditambahkan ke
dalam media berfungsi untuk mengetahui terbentuknya asam yang ditandai dengan
perubahan warna media dari ungu menjadi kuning karena indikator BCP akan
berwarna ungu pada pH>7 dan berwarna kuning pada pH asam sedangkan tabung
durham digunakan untuk menangkap gas yang terbentuk pada proses fermentasi.
Tabung durham biasanya dipakai bila jenis dan jumlah gas tidak perlu diketahui.
Gas yang masuk ke dalam tabung ini akan tampak sebagai gelembung-gelembung
udara yang terperangkap dan mendorong cairan yang ada di dalam tabung (Lay,
1994).
Bacillus cereus banyak terdapat pada makanan. Bakteri ini
berkatalase positif, aerobik sampai anaerobik fakultatif, bergram positif, dan
dapat membentuk spora. B. cereus dapat
memproduksi asam tanpa gas jika ditumbuhkan pada makanan dan memiliki sifat
proteolitik kuat yang menghasilkan enzim proteolitik yang bersifat menyerupai
rennin sehingga mampu menggumpalkan susu. Spesies ini juga termasuk bakteri
lipolitik yang mampu memecah lemak (Fardiaz, 1992).
Dari hasil percobaan uji fermentasi,
diketahui bahwa B. cereus dapat memecah glukosa menjadi asam yang ditunjukkan
dengan perubahan warna media GB dari coklat menjadi kuning, namun tidak
terbentuk gas pada fermentasi ini. Asam yang dihasilkan ini akan menurunkan pH
media sehingga mengubah warna indikatornya karena BCP akan berwarna kuning pada
pH asam.
Ada dua tahap pada proses fermentasi
glukosa, yaitu proses pemecahan rantai karbon glukosa dan pelepasan atom
hidrogen untuk memproduksi asam piruvat serta pereduksian asam piruvat oleh
atom hidrogen untuk menghasilkan senyawa-senyawa, seperti asam dan gas sebagai
produk fermentasi. Reaksi ini merupakan reaksi redoks yang harus seimbang
(Fardiaz, 1992).
B. cereus memecah glukosa
menjadi asam piruvat melalui jalur EMP (Embden
Meyerhoff Parnas). Bakteri ini akan menghasilkan enzim aldolase untuk
memecah fruktosa difosfat menjadi dua molekul gliseraldehida fosfat dan enzim
gliseraldehida fosfat dehidrogenase untuk mengkatalis reaksi
fosfogliseraldehida yang akan memproduksi ATP.
Asam piruvat yang
dihasilkan pada jalur glikolisis (EMP) akan direduksi oleh NADH2
untuk memproduksi asam laktat. Karena B.
cereus hanya memproduksi asam laktat saja sebagai satu-satunya hasil akhir
fermentasi, maka bakteri ini dapat digolongkan sebagai bakteri asam laktat
homofermentatif yang dapat menghasilkan asam laktat dalam jumlah yang tinggi.
Reaksi yang terjadi adalah:
Glukosa → 2 Asam laktat
B. cereus juga dapat
memproduksi enzim yang dapat memecah sukrosa dan laktosa menjadi monosakarida. Enzim yang dihasilkan adalah
β-galaktosidase yang akan memecah laktosa menjadi galaktosa dan glukosa serta
enzim invertase yang memecah sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa. Uji
fermentasi yang dilakukan menujukkan bahwa terbentuk asam laktat sebagai produk
fermentasi pada media SB yang berubah warna dari merah menjadi kuning dan LB
yang berubah warna dari biru keunguan menjadi kuning akibat penurunan pH media.
Zat-zat nutrient di alam biasanya masih
berupa makromolekul, seperti karbohidrat, protein, lipid, dan asam nukleat.
Agar dapat dipakai oleh sel untuk mensintesis komponen-komponennya, maka
makromolekul tersebut harus dihidrolisis terlebih dahulu. Proses hidrolisis sendiri merupakan pemutusan ikatan molekul dengan
menambahkan air (Lay, 1994). Protein lebih sulit dihidrolisis
dibandingkan dengan karbohidrat karena strukturnya yang kompleks sedangkan
lemak merupakan komponen yang paling sulit dihidrolisis.
Karbohidrat akan dihidrolisis menjadi komponen
yang lebih sederhana, seperti disakarida atau monosakarida, asam, gas, dan
produk-produk akhir lainnya. Asam laktat merupakan asam utama yang dihasilkan
pada proses pemecahan ini. Protein akan dipecah menjadi asam amino, alkohol,
beberapa gas, contohnya CO2, hidrogen,
amonia, dan senyawa berbau busuk, seperti indol dan skatol sedangkan lemak akan
dihidrolisis menjadi asam lemak dan gliserol (Fardiaz, 1992).
Dari uji hidrolisis pati, lemak, dan
protein, dapat diketahui bahwa B. cereus merupakan
bakteri proteolitik dan lipolitik tetapi tidak termasuk bakteri amilolitik.
Hasil ini tidak cocok dengan teori yang ada. Menurut Kim (2004), B. cereus merupakan bakteri amilolitik yang dapat memecah
pati. Hal ini dapat dilihat karena tidak terbentuknya daerah transparan
pada media SA setelah ditetesi lugol yang menunjukkan adanya hidrolisis pati. Kesalahan
ini dapat terjadi karena koloni yang tumbuh terlalu sedikit atau lugol yang
ditambahkan kurang banyak.
B. cereus termasuk bakteri proteolitik
kuat dan juga bakteri lipolitik yang dapat memecah lemak (Fardiaz,
1992). Bakteri ini termasuk bakteri proteolitik ditunjukkan dengan terbentuknya
daerah bening yang mengelilingi koloni pada media SMA. Daerah yang jernih ini
dapat terbentuk karena kasein di dalam susu pada media telah dihidrolisis oleh enzim
kaseinase yang diproduksi bakteri B.
cereus menjadi asam-asam amino yang mudah larut di dalam media sehingga
kekeruhan yang disebabkan kompleks Ca-kasein menjadi hilang (Lay, 1994).
B. cereus juga termasuk
bakteri lipolitik yang ditandai dengan terbentuknya area yang berwarna merah di
bagian bawah koloni. Indikator neutral
red yang ditambahkan ke dalam media akan membantu untuk menunjukkan adanya
proses hidrolisis lemak melalui perubahan warna menjadi merah. B. cereus akan memproduksi enzim lipase
untuk menghidrolisis lemak menjadi asam lemak dan gliserol. Asam lemak yang
dihasilkan dari proses hidrolisis ini akan menurunkan pH media (Lay, 1994).
Media yang digunakan untuk hidrolisis
karbohidrat adalah media SA (Starch Agar)
yang terdiri dari tripton, ekstrak khamir, K2HPO4, pati
terlarut, agar, dan air. Tripton berfungsi sebagai sumber karbohidrat, N, dan
mineral, ekstrak khamir untuk sumber vitamin B, air untuk transport zat-zat
nutrient, sedangkan pati sebagai komponen yang akan dipecah pada hidrolisis
karbohidrat.
Media untuk hidrolisis protein adalah
media SMA (Skim Milk Agar) yang
mengandung tripton, ekstrak khamir, dekstrosa, agar, air destilata, dan 20%
susu skim bubuk. Ekstrak khamir sebagai sumber vitamin B kompleks, tripton
dipakai untuk menyediakan nitrogen dan mineral, sedangkan kasein yang ada di
dalam susu akan menyebabkan media menjadi berwarna keruh.
Media untuk hidrolisis lemak adalah
media NA (Nutrient Agar) yang terdiri
dari ekstrak sapi, pepton, 1% margarin, agar, air destilata, dan ditambah
dengan indikator neutral red. Ekstrak
sapi sebagai sumber nitrogen, karbohidrat, vitamin, dan mineral, pepton untuk
mengatur pH, air untuk menyalurkan nutrient, neutral red sebagi indikator (Fardiaz, 1992).
Pada saat uji hidrolisis karbohidrat
pada media SA dan uji hidrolisis lemak pada media NA+lemak, bakteri B. cereus bersifat katalase positif sedangkan pada uji
hidrolisis protein pada media SMA, bakteri ini bersifat katalase negatif.
Katalase sendiri merupakan enzim yang dapat digunakan untuk mengkatalis reaksi
penguraian H2O2 menjadi O2 dan air. H2O2
sendiri bersifat toksik karena dapat menginaktivasi enzim. Adanya enzim
katalase dapat ditunjukkan dengan terbentuknya gelembung-gelembung kecil O2
di sekitar koloni setelah ditetesi H2O2. B. cereus termasuk
bakteri berkatalase positif (Fardiaz, 1992). Namun bakteri ini
berkatalase negatif pada saat uji hidrolisis protein padahal seharusnya
berkatalase positif. Hal ini dapat terjadi karena kurangnya larutan H2O2
yang ditambahkan atau koloni B. cereus yang diambil kurang banyak.
4.2
Kapang Fusarium moniliforme
Tabel 4.2 Hasil uji yang dilakukan terhadap kapang Fusarium moniliforme
|
|
Pertumbuhan Kapang
|
||
|
Uji Fermentasi
|
GB
|
gas
asam
|
-
-
|
|
LB
|
gas
asam
|
-
+
|
|
|
SB
|
gas
asam
|
-
+
|
|
|
Uji Hidrolisis Pati
|
+
|
||
|
Uji Hidrolisis Protein
|
0
|
||
|
Uji Hidrolisis Lemak
|
0
|
||
|
Uji Katalase
|
SA
|
+
|
|
|
SMA
|
0
|
||
|
NA + lemak
|
0
|
||
Kapang banyak digunakan di dalam
fermentasi makanan tradisional dan pembuatan keju, namun fermentasi oleh kapang
memiliki kelemahan, yaitu pada permukaan makanan yang difermentasi dapat tumbuh
miselium yang mempengaruhi penampakan dari makanan. Pada proses fermentasi,
kapang akan menghasilkan asam, enzim, dan antibiotik. Enzim utama yang berperan
dalam fermentasi makanan oleh kapang adalah enzim amilase dan proteinase.
Pemecahan pati oleh enzim amilase banyak digunakan dalam industri pembuatan
produk yang memakai ragi, tape, dan koji sebagai starternya, pemecahan protein
oleh enzim proteinase digunakan dalam industri pembuatan kecap dan tauco,
sedangkan pemecahan lemak dipakai untuk industri keju.
Fusarium sp. termasuk kapang
bersekat dan tidak memiliki spora seksual. Kapang ini sering ditemukan pada
makanan dan sulit diidentifikasi karena penampakan pertumbuhannya bervariasi.
Ciri utama yang membedakan Fusarium sp.
dari kapang lainnya adalah adanya makrokonidia yang tampak sebagai pedang dan
tersusun dari beberapa sel serta berwarna. Fusarium
sp. biasanya dipakai untuk mengganti hormon pertumbuhan dan memproduksi
benih (Fardiaz, 1992).
Dari hasil uji fermentasi,
didapat bahwa Fusarium sp. hanya dapat memecah laktosa dan sukrosa menjadi
asam yang ditandai dengan perubahan warna media dari ungu menjadi
kuning, namun tidak terbentuk gas pada tabung durham. Fusarium sp. akan memproduksi enzim β-galaktosidase yang digunakan
untuk memecah laktosa menjadi galaktosa dan glukosa serta enzim invertase yang
memecah sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa. Monosakarida-monosakarida ini
kemudian dipecah lagi untuk menghasilkan produk akhir lainnya, seperti ragi
tape, koji. Proses fermentasi oleh kapang banyak digunakan untuk pembuatan
produk-produk yang memakai ragi, tape, dan koji sebagai starternya.
Pada uji hidrolisis karbohidrat, dapat
dilihat bahwa Fusarium sp. termasuk mikroba amilolitik yang dapat memecah
karbohidrat menjadi komponen yang lebih sederhana dengan menggunakan
enzim amilase yang diproduksi kapang ini dan ditandai dengan terbentuknya
daerah transparan yang mengelilingi koloni setelah diteteskan dengan yodium. Yodium
akan bereaksi dengan pati dan masuk ke bagian pati yang kosong dan berbentuk
spiral sehingga membentuk warna biru kehitaman. Jika pati telah dihidrolisis
menjadi disakarida maupun monosakarida, maka warna biru ini akan hilang karena
bentuk spiralnya sudah tidak ada. Hal ini cocok dengan teori yang ada. Menurut
Mader (2007), Fusarium sp. dapat
menghasilkan enzim amilase pada pati.
Pada uji hidrolisis protein dan lipid,
kapang Fusarium sp. tidak dapat
tumbuh pada media SMA dan NA+lemak. Hal ini disebabkan karena penggoresan yang
tidak menyentuh permukaan agar sehingga tidak ada kapang Fusarium sp. yang tumbuh pada media tersebut. Umumnya, kapang dapat
tumbuh pada makanan yang mengandung pati, protein, dan lipid karena kapang
dapat menghasilkan enzim hidrolitik, yaitu enzim amilase, proteinase, dan
lipase untuk memecah komponen makanan kompleks menjadi sederhana (Fardiaz,
1992). Sebenarnya mungkin ada sedikit Fusarium
sp. yang tumbuh, namun karena penampakan pertumbuhan kapang ini bervariasi
sehingga sulit untuk diidentifikasi. Menurut Rodier (1996), Fusarium sp. termasuk mikroorganisme proteolitik dan lipolitik yang dapat memecah
protein dan lemak.
Pada uji katalase, Fusarium sp. dapat menghasilkan enzim
katalase untuk memecah senyawa beracun H2O2 pada media SA
menjadi air dan oksigen yang ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung
oksigen di sekitar koloni setelah ditetesi H2O2, tetapi
karena pada media SMA dan NA+lemak tidak ada kapang yang tumbuh sehingga tidak
dapat dilakukan uji katalase. Namun sebenarnya Fusarium sp.
termasuk mikroba berkatalase positif dan juga mikroba aerob karena H2O2
biasanya terbentuk pada metabolisme aerob.
4.3
Khamir Candida tropicalis
Tabel 4.3 Hasil uji yang dilakukan terhadap khamir Candida tropicalis
|
|
Pertumbuhan Khamir
|
||
|
Uji Fermentasi
|
GB
|
gas
asam
|
+
+
|
|
LB
|
gas
asam
|
-
-
|
|
|
SB
|
gas
asam
|
+
+
|
|
|
Uji Hidrolisis Pati
|
-
|
||
|
Uji Hidrolisis Protein
|
-
|
||
|
Uji Hidrolisis Lemak
|
+
|
||
|
Uji Katalase
|
SA
|
+
|
|
|
SMA
|
+
|
||
|
NA + lemak
|
+
|
||
Berdasarkan sifat metabolismenya, ada
dua kelompok khamir yaitu khamir fermentatif yang dapat memecah glukosa menjadi
alkohol dan CO2 melalui jalur glikolisis EMP dan khamir oksidatif
yang membutuhkan oksigen untuk pertumbuhannya. Beberapa spesies Candida sp. bersifat oksidatif tetapi
dapat melakukan fermentasi secara lemah atau negatif juga.
Pada proses fermentasi oleh khamir,
khamir yang ditumbuhkan pada media glukosa umumnya mengandung jumlah enzim
penghidrolisis disakarida dan polisakarida yang sangat rendah. Banyak khamir
yang dapat melakukan fermentasi terhadap disakarida dan trisakarida, namun
hanya beberapa spesies khamir yang dapat memfermentasi polisakarida. Gula yang
biasanya difermentasi oleh khamir adalah galaktosa, glukosa, maltosa, sukrosa,
dan laktosa.
C. tropicalis umumnya
membentuk film pada permukaan makanan dan sering merusak makanan yang berkadar
garam dan asam tinggi. Khamir ini biasanya digunakan untuk memecah gula dan
memproduksi massa sel dari molase tebu (Fardiaz, 1992).
Pada uji fermentasi, dapat diketahui
bahwa C. tropicalis dapat memfermentasi glukosa dan sukrosa serta menghasilkan
asam dan gas yang ditandai dengan perubahan warna media GB dari coklat menjadi
kuning dan perubahan warna media SB dari merah menjadi kuning serta
terbentuknya gelembung gas di tabung durham pada kedua media. Glukosa akan
dipecah menjadi asam piruvat yang dipecah lagi menjadi asam laktat, asam
asetat, etanol, CO2, dan metabolit-metabolit lain sedangkan sukrosa
dipecah menajdi fruktosa dan glukosa oleh enzim invertase yang diproduksi C. tropicalis. Laktosa sendiri tidak bisa
difermentasi oleh C. tropicalis
karena tidak ada perubahan warna pada media LB yang telah diberi indikator dan
tidak ada gelembung gas yang terbentuk pada tabung durham.
Pada uji hidrolisis,
diketahui bahwa C. tropicalis termasuk mikroba lipolitik, amilolitik, dan proteolitik. C. tropicalis termasuk mikroba lipolitik
karena dapat memproduksi asam secara lemah yang ditandai dengan terbentuknya sedikit
warna merah di sekitar koloni. Hal ini menunjukkan bahwa khamir ini dapat
menghasilkan enzim lipase yang memecah lemak menjadi asam lemak dan gliserol.
Asam yang terbentuk akan menurunkan pH media.
C. tropicalis juga termasuk
mikroba amilolitik yang dapat menghasilkan enzim α-amilase untuk memecah pati
menjadi komponen yang lebih sederhana, yaitu disakarida maupun monosakarida.
Hal ini ditunjukkan dengan terbentuknya daerah transparan yang mengelilingi
koloni setelah ditetesi dengan yodium karena sudah tidak adanya kompleks
pati-yodium yang berbentuk biru kehitaman. Hal ini sesuai dengan teori. Menurut
Azoulay (1980), C. tropicalis mengeluarkan enzim yang dapat digunakan
untuk menghidrolisis pati, yaitu α-amylase menjadi komponen-komponen yang lebih sederhana, terutama gula.
C. tropicalis juga
menunjukkan hasil yang positif pada uji hidrolisis protein yang ditunjukkan
dengan terbentuknya areal bening yang mengelilingi koloni C. tropicalis karena asam amino hasil hidrolisis protein dapat
larut di dalam media SMA. Hal ini cocok dengan teori yang ada. Menurut Okumura (2006), C.
tropicalis termasuk mikroba proteolitik yang dapat memecah protein menjadi
peptida dan asam amino.
Pada uji katalase, C. tropicalis bersifat katalase positif untuk semua media yang ada. Hal ini
menunjukkan bahwa khamir ini memiliki enzim katalase yang dapat digunakan untuk
menguraikan hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen yang ditandai dengan
terbentuknya gelembung-gelembung gas di sekitar koloni setelah diteteskan H2O2.
4.4 Air
Tajin
Tabel 4.4 Hasil uji yang dilakukan terhadap air
tajin
|
|
Pertumbuhan Mikroba
|
||
|
Uji Fermentasi
|
GB
|
gas
asam
|
+
+
|
|
LB
|
gas
asam
|
+
+
|
|
|
SB
|
gas
asam
|
+
+
|
|
|
Uji Hidrolisis Pati
|
+
|
||
|
Uji Hidrolisis Protein
|
+
|
||
|
Uji Hidrolisis Lemak
|
+
|
||
|
Uji Katalase
|
SA
|
+
|
|
|
SMA
|
+
|
||
|
NA + lemak
|
+
|
||
Beras yang difermentasi akan
menghasilkan miso yang biasanya digunakan untuk membuat sup dan memberi
tambahan rasa makanan. Pertama-tama, air beras diinokulasi dengan Aspergillus oryzae
sehingga terjadi proses fermentasi pada suhu 400C secara aerobik.
Agar dapat ditumbuhi kapang, beras ini harus daalm keadaan basah. Beras
berkapang disebut koji yang merupakan stater untuk fermentasi.
Campuran bahan dengan garam, koji,
kedelai, miso, dan air difermentasi pada suhu 280C selama seminggu
secara aerobik, lalu campuran ini dimasukkan ke dalam tong untuk memulai
fermentasi kedua dengan menggunakan khamir Saccharomyces rouxii pada suhu 350C selama 2 bulan
secara anaerobik. Pada fermentasi ini, bakteri-bakteri
asam laktat akan ikut berperan (Buckle et al., 1987).
Dari hasil percobaan,
diketahui bahwa
mikroba-mikroba yang tumbuh di air tajin dapat memecah glukosa, sukrosa,
laktosa menjadi asam dan gas yang ditandai dengan perubahan warna media
dari ungu menjadi kuning dan terbentuknya gas pada tabung durham. Hasil
pemecahan komponen karbohidrat di air tajin akan menghasilkan produk akhir,
berupa miso yang dapat dipakai untuk membuat sup dan memberi tambahan rasa pada
makanan. Selain itu, juga dihasilkan asam laktat, alkohol, enzim, CO2,
dan produk-produk lainnya. Mikroba-mikroba
yang ada di dalam air tajin adalah bakteri-bakteri asam laktat, kapang Aspergillus oryzae, dan
khamir Saccharomyces rouxii.
Bakteri asam laktat akan memecah gula dan
menghasilkan asam laktat sebagai produk akhir serta menurunkan pH lingkungan
pertumbuhannya akibat terbentuknya asam. Aspergillus
oryzae dapat menghasilkan enzim protease untuk membuat minuman beralkohol
dari nasi sedangkan S. rouxii
bersifat osmofilik dan tahan dengan kandungan gula yang tinggi (Fardiaz, 1992).
Mikroba-mikroba di air tajin juga menunjukkan hasil yang
positif pada uji hidrolisis karbohidrat, protein, dan lemak. Mikroba-mikroba ini termasuk mikroba
amilolitik, proteolitik, dan lipolitik. Hal ini ditunjukkan dengan terbentuknya
daerah transparan yang mengelilingi koloni pada media SA, koloni yang
dikelilingi areal bening pada media SMA, dan terbentuknya daerah yang berwarna
merah di bagian bawah koloni pada media NA.
Pada uji katalase, mikroba-mikroba ini juga
termasuk katalase positif yang ditandai dengan terbentuknya
gelembung-gelembung kecil O2 pada koloni. Hal ini berarti
mikroba-mikroba ini memiliki enzim katalase yang dapat memecah hidrogen
peroksida menjadi air dan oksigen.
4.5 Air Rendaman Tahu
Tabel 4.5 Hasil uji yang dilakukan terhadap air rendaman
tahu
|
|
Pertumbuhan Mikroba
|
||
|
Uji Fermentasi
|
GB
|
gas
asam
|
+
+
|
|
LB
|
gas
asam
|
+
+
|
|
|
SB
|
gas
asam
|
+
+
|
|
|
Uji Hidrolisis Pati
|
+
|
||
|
Uji Hidrolisis Protein
|
+
|
||
|
Uji Hidrolisis Lemak
|
+
|
||
|
Uji Katalase
|
SA
|
+
|
|
|
SMA
|
+
|
||
|
NA + lemak
|
+
|
||
Tahu dibuat dari kacang kedelai yang
direndam dan didedak hingga menjadi suatu campuran antara air dengan kacang
kedelai. Campuran ini disaring sehingga hanya susu kedelai yang dapat lewat.
Susu kedelai kemudian diberi garam, seperti magnesium klorida atau kalsium
sulfat agar menggumpal. Selanjutnya, gumpalan ini di-press menjadi potongan
tahu. Menurut Ewald (1997), bakteri yang biasa
berperan di dalam fermentasi tahu adalah Bacillus cereus.
Pada percobaan uji fermentasi,
diketahui bahwa mikroba di
air tahu dapat melakukan fermentasi terhadap semua komponen karbohidrat yang
ada, baik glukosa, sukrosa, maupun laktosa. Fermentasi glukosa, laktosa,
dan sukrosa ditandai dengan terbentuknya asam pada media yang dilihat dari
perubahan indikator pada media menjadi kuning dan gas yang terdapat pada tabung
durham. Glukosa akan dipecah menajdi asam piruvat yang dipecah lagi menjadi
asam laktat dan CO2 atau etanol sedangkan enzim invertase memecah
sukrosa menjadi fruktosa dan glukosa. Laktosa dipecah oleh enzim
β-galaktosidase menjadi galaktosa dan glukosa.
Pada uji hidrolisis, mikroba yang ada di air tahu
termasuk mikroba amilolitik, proteolitik, dan lipolitik yang ditandai
dengan terbentuknya daerah transparan yang mengelilingi koloni pada media SA,
areal bening di sekitar koloni pada media SMA, dan terbentuknya warna merah di
bawah koloni pada media NA+lemak. Hal ini sesuai dengan teori yang ada. B. cereus termasuk bakteri lipolitik dan
proteolitik (Fardiaz, 1992) dan juga bakteri amilolitik (Kim, 2004).
Dari uji katalase,
diketahui bahwa mikroba di air tahu termasuk mikroba aerob yang dapat memecah hidrogen
peroksida menjadi air dan oksigen. Mikroba ini dapat menghasilkan enzim
katalase untuk semua media yang ada. Hal ini cocok dengan teori yang ada. B. cereus berkatalase positif (Fardiaz,
1992).
Air Sayur Asin
Tabel 4.6 Hasil uji yang dilakukan terhadap air sayur
asin
|
|
Pertumbuhan Mikroba
|
||
|
Uji Fermentasi
|
GB
|
gas
asam
|
-
+
|
|
LB
|
gas
asam
|
-
+
|
|
|
SB
|
gas
asam
|
-
+
|
|
|
Uji Hidrolisis Pati
|
+
|
||
|
Uji Hidrolisis Protein
|
+
|
||
|
Uji Hidrolisis Lemak
|
+
|
||
|
Uji Katalase
|
SA
|
+
|
|
|
SMA
|
+
|
||
|
NA + lemak
|
+
|
||
Sayur asin terbuat dari kobis yang
diasamkan. Kobis yang telah diiris-iris dimasukkan ke dalam tangki yang berisi
air garam. Air dan nutrisi di jaringan sayuran akan ditarik oleh garam sebagai
substrat untuk pertumbuhan bakteri asam laktat. Garam dan asam yang dihasilkan
dari proses fermentasi dapat menghambat pertumbuhan mikroba lain. Fermentasi diawali
oleh bakteri Leuconostoc
mesenteroides dan diteruskan oleh Lactobacillus delbrückii yang lebih
tahan terhadap asam. Fermentasi dilakukan pada suhu antara 25-300C
dalam waktu 2-3 minggu (Buckle et al.,
1987). Pada sayur asin, juga dapat tumbuh khamir (Fardiaz,
1992).
Dari hasil percobaan uji fermentasi,
dapat diketahui bahwa mikroba-mikroba yang ada di air
sayur asin dapat memecah glukosa, laktosa, dan sukrosa menjadi asam.
Asam ini dapat berupa asam laktat yang merupakan asam utama pada proses
fermentasi ini. Terbentuknya asam ditandai dengan perubahan warna media LB dari
biru keunguan menjadi kuning, media SB yang berubah warna dari merah menjadi
kuning, dan media GB yang berubah warna dari coklat menjadi kuning. Seharusnya,
pada percobaan fermentasi ini dihasilkan gas pada tabung durham karena bakteri Leuconostoc sp. dapat memfermentasi gula
menjadi asam laktat dan CO2 atau asam asetat (Fardiaz, 1992). Hal
ini dapat terjadi karena gas yang terbentuk kurang banyak sehingga sulit untuk
diamati.
Leuconostoc sp. bersifat
heterofermentatif yang dapat memfermentasikan gula menjadi asam laktat dan CO2
atau etanol. Bakteri ini juga bersifat halofilik sehingga dapat tahan dengan
kadar garam yang tinggi dan berperan penting dalam fermentasi awal bahan pangan
yang mengandung kadar garam tinggi, seperi pikel dan sauerkraut. Selain itu, bakteri ini dapat melakukan fermentasi
secara cepat sehingga dapat mencegah pertumbuhan bakteri lain. Pada fermentasi
sukrosa, akan dihasilkan juga lendir berlebih.
Lactobacillus delbrückii
bersifat homofermentatif dan sering ditemui pada fermentasi pikel. Bakteri ini
akan memecah gula menjadi asam laktat sebagai produk akhirnya (Fardiaz, 1992).
Pada uji hidrolisis pati, mikroba-mikroba yang ada di
sayur asin menunjukkan hasil yang positif yang ditandai dengan terbentuknya
daerah transparan di sekitar koloni. Mikroba-mikroba ini dapat menghasilkan
enzim amilase yang dapat digunakan untuk memecah pati menjadi komponen yang
lebih sederhana. Mikroba-mikroba
ini juga termasuk mikroba lipolitik dan proteolitik yang masing-masing
dapat digunakan untuk memecah lemak dan protein. Hal ini ditunjukkan dengan
terbentuknya warna merah di bawah koloni pada media NA+lemak dan areal bening
di sekitar koloni pada media SMA.
Mikroba ini juga termasuk mikroba yang dapat menghasilkan enzim katalase
untuk memecah hidrogen peroksida (H2O2) menjadi air dan
oksigen yang ditunjukkan dengan
terbentuknya gelembung-gelembung gas O2 di sekitar koloni setelah
diteteskan dengan H2O2. Walaupun sebagian besar mikroba
yang ada di air sayur asin merupakan bakteri berkatalase negatif, tetapi
mungkin ada mikroba lain seperti khamir yang dapat menghasilkan enzim katalase.
Air Asinan
Tabel 4.7 Hasil uji yang dilakukan terhadap air asinan
|
|
Pertumbuhan Mikroba
|
||
|
Uji Fermentasi
|
GB
|
gas
asam
|
+
+
|
|
LB
|
gas
asam
|
+
+
|
|
|
SB
|
gas
asam
|
+
+
|
|
|
Uji Hidrolisis Pati
|
+
|
||
|
Uji Hidrolisis Protein
|
+
|
||
|
Uji Hidrolisis Lemak
|
+
|
||
|
Uji Katalase
|
SA
|
+
|
|
|
SMA
|
+
|
||
|
NA + lemak
|
+
|
||
Asinan biasanya terbuat dari
sayur-sayuran atau buah-buahan. Sayuran dan buah-buahan biasanya berkadar gula
tinggi dan dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri asam laktat. Ada empat faktor
yang mempengaruhi fermentasi sayuran, yaitu kondisi anaerobik, kadar garam yang
cukup untuk menyerap nutrient, suhu yang sesuai, dan adanya bakteri asam laktat
yang dibutuhkan. Bakteri asam laktat yang sering dipakai dalam fermentasi
syuran adalah Leuconostoc mesenteroides dan Lactobacillus (Buckle et
al., 1987).
Pada uji fermentasi, bakteri-bakteri
asam laktat pada air asinan dapat memfermentasikan komponen-komponen karbohidrat, seperti sukrosa,
laktosa, dan glukosa menjadi asam dan gas. Asam yang dihasilkan akan
menurunkan pH media sehingga media yang mengandung indikator BCP akan mengalami
perubahan warna menjadi kuning bila terbentuk asam. Hal ini ditandai dengan perubahan warna media LB dari biru keunguan
menjadi kuning, media GB yang berubah warna dari cokelat menjadi kuning, dan media
SB yang berubah warna dari merah menjadi kuning. Asam yang dihasilkan dapat
berupa asam laktat atau asam asetat. Pada percobaan ini, juga dihasilkan gas yang
ditangkap oleh tabung durham dan tampak sebagai gelembung udara. Gas tersebut
merupakan CO2 sebagai produk samping hasil fermentasi.
Bakteri Leuconostoc sp. bersifat heterofermentatif yang akan memecah gula
menjadi asam laktat dan CO2 atau etanol/asam asetat. Bakteri ini
juga termasuk bakteri halofilik yang tahan kadar garam tinggi dan dapat
melakukan fermentasi secara cepat dan dapat menghambat pertumbuhan bakteri lain
sedangkan Lactobacillus sp. bersifat
homofermentatif dan memecah gula menjadi asam laktat (Fardiaz, 1992).
Pada uji hidrolisis pati, bakteri-bakteri
di air asinan akan membentuk daerah transparan yang mengeliling koloni setelah
diteteskan dengan lugol. Hal ini menunjukkan bahwa baketri-bakteri di air
asinan memiliki enzim amilase yang dapat memecah pati menjadi komponen
karbohidrat yang lebih sederhana, terutama glukosa.
Pad uji hidrolisis protein, terbentuk
areal bening yang mengelilingi koloni pada media SMA. Hal ini berarti
bakteri-bakteri di air sayuran termasuk bakteri proteolitik yang memiliki enzim
proteinase yang dapat digunakan untuk memecah protein menjadi peptida dan asam
amino. Bakteri-bakteri ini juga termasuk bakteri lipolitik yang ditandai dengan
terbentuknya warna merah di bagian bawah koloni pada media NA+lemak sehingga
dapat diketahui bahwa bakteri ini memiliki enzim lipase yang dapat memecah
lemak menjadi gliserol dan asam lemak yang akan menurunkan pH medium.
Bakteri-bakteri ini juga menunjukkan hasil
yang positif pada uji katalase. Namun sebenarnya, bakteri-bakteri yang ada di
sayuran berkatalase negatif, seperti Leuconostoc
sp. dan Lactobacillus sp. Hal ini mungkin disebabkan kontaminasi dari mikroorganisme
lain yang berkatalase positif atau hidrogen peroksida (H2O2)
yang ditambahkan terlalu banyak sehingga reaksinya menjadi berlebihan.
4.8
Pewarnaan Gram
Tabel 4.8 Hasil pewarnaan Gram pada sampel
|
Kelompok
|
Sampel
|
Gram + (%)
|
Bentuk
|
Gram – (%)
|
Bentuk
|
|
1
2
|
Air tajin
|
79,41
64,84
|
kokus
kokus
|
20,59
35,16
|
kokus
kokus
|
|
3
4
|
Air rendaman tahu
|
81,35
100
|
kokus
kokus
|
18,65
-
|
kokus
-
|
|
5
6
|
Air sayur asin
|
100
100
|
kokus
kokus
|
-
-
|
-
-
|
|
7
8
|
Air asinan
|
86,1
45,18
|
kokus
basil
|
13,9
55,82
|
kokus
kokus
|
Pada pewarnaan Gram air
tajin, dapat dilihat bahwa kebanyakan bakteri-bakteri yang ada di air tajin
merupakan bakteri asam laktat, seperti Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, dan
Pediococcus yang bergram positif dengan persentase antara 65-80% dan
sisanya yaitu antara 20-35% merupakan bakteri Gram negatif. Hal ini menunjukkan
bakteri di air tajin memiliki dinding sel yang sebagian besar tersusun dari
peptidoglikan, kebutuhan akan nutrient relatif kompleks, dan lebih tahan
terhadap perlakuan fisik.
Kebanyakan bakterinya
berbentuk kokus, yaitu Streptococcus dan Pediococcus yang homofermentatif serta Leuconostoc yang bersifat heterofermentatif,
namun ada satu bakteri bergram positif yang berbentuk diplobasil, yaitu Lactobacillus yang bisa bersifat
homofermentatif atau heterofermentatif.
Dari pewarnaan Gram air
rendaman tahu, bahwa bakteri utama di air tahu adalah bakteri Gram positif dengan
persentase 80-100%, yaitu bakteri Bacillus
cereus dan sisanya merupakan bakteri Gram negatif dengan persentase
0-18,65%. Semua bakterinya berbentuk kokus pada saat pengamatan, padahal Bacillus cereus sendiri berbentuk
batang. Hal ini dapat terjadi karena adanya kesalahan pengamatan mikroskopik.
Pada percobaan pewarnaan Gram air
sayur asin, diketahui bahwa bakteri-bakteri di sayur asin 100% merupakan
bakteri Gram positif yang ditunjukkan dengan koloni yang semua berwarna ungu
pada saat pengamatan mikroskopik. Hal ini cocok dengan teori yang ada karena Leuconostoc sp. dan Lactobacillus sp. bergram positif (Fardiaz, 1992). Dari pengamatan,
diketahui bahwa semua bakteri di sayur asin berbentuk kokus, yaitu Leuconostoc sp., tetapi pada air sayur
asin masih ada bakteri Lactobacillus sp.
yang berbentuk batang. Hal ini dapat terjadi karena areal pandang yang diambil
terlalu sedikit sehingga bakteri yang berbentuk batang tidak kelihatan.
Pada pewarnaan Gram air asinan,
diketahui bahwa bakteri-bakteri di sayuran 45-86% merupakan bakteri Gram
positif sedangkan 14-56% merupakan bakteri gram negatif. Hal ini tidak sesuai
dengan teori yang ada karena Leuconostoc
sp. dan Lactobacillus sp. bergram positif (Fardiaz, 1992). Kesalahan ini
mungkin disebabkan kontaminan bakteri lain yang bergram negatif atau kesalahan
pengamatan mikroskopik. Bentuk bakterinya kebanyakan kokus, yaitu Leuconostoc sp. dan ada juga yang
berbentuk basil, yaitu Lactobacillus sp.
BAB V
KESIMPULAN
Fermentasi adalah proses pemecahan
molekul, seperti karbohidrat dan asam amino tanpa membutuhkan oksigen sedangkan
hidrolisis adalah proses pemutusan ikatan molekul dengan penambahan air.
Berdasarkan sifat pemecahan komponen makanan, ada mikroba amilolitik,
proteolitik, lipolitik, pektinolitik, dan osmofilik. Mikroba aerob juga dapat memecah H2O2
menjadi air dan O2.
Bacillus cereus dapat
melakukan fermentasi terhadap komponen karbohidrat dan menghasilkan asam, termasuk
bakteri amilolitik, proteolitik, lipolitik, berkatalase positif, dan bergram
positif. Fusarium moniliforme hanya
dapat memfermentasi laktosa dan sukrosa menjadi asam, merupakan mikroba
amilolitik, proteolitik, lipolitik, dan berkatalase positif. Candida tropicalis hanya dapat
memfermentasi glukosa dan sukrosa serta termasuk mikroba amilolitik,
proteolitik, lipolitik dan berkatalase positif.
Air tajin mengandung bakteri
asam laktat, Aspergillus oryzae,
dan Saccharomyces rouxii yang dapat
memfermentasi sukrosa, laktosa, dan glukosa, termasuk mikroba amilolitik,
proteolitik, lipolitik, berkatalase positif, kebanyakan bergram positif, dan
berbentuk kokus. Pada air rendaman tahu, terdapat bakteri Bacillus cereus yang dapat memfermentasi sukrosa, laktosa, dan
glukosa, termasuk mikroba amilolitik, proteolitik, lipolitik, berkatalase
positif, dan kebanyakan bergram positif.
Air sayur asin dan air sayuran mengandung
Leuconostoc mesenteroides dan Lactobacillus delbrückii yang dapat
memfermentasi sukrosa, laktosa, dan glukosa, termasuk mikroba amilolitik,
proteolitik, lipolitik, berkatalase negatif, kebanyakan bergram positif dan
berbentuk kokus, tetapi ada juga yang berbentuk basil.
LAMPIRAN
|
Areal Pandang
|
Jumlah bakteri Gram +
|
Jumlah bakteri Gram -
|
|
1
|
7
|
-
|
|
2
|
12
|
4
|
|
3
|
34
|
14
|
|
4
|
26
|
7
|
|
5
|
57
|
12
|
|
Rata-rata
|
27
|
7
|
% Bakteri Gram + = 27
× 100 % = 79,41%
27+7
% Bakteri Gram -
= 7 × 100 % = 20,59%
27+7
DAFTAR PUSTAKA
Azoulay, Edgard. “Fermentation Methods for
Protein Enrichment of Cassava and Corn with Candida tropicalis,” AEM Online. Home pageon-line.
Available from http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=291281
; Internet; accessed 18 Agustus
2007.
Buckle, K. A., dkk. Ilmu Pangan. Jakarta: UI Press, 1987.
Doctorfungus. “Candida
sp.,” Doctorfungus Online. Home
pageon-line. Available from http://www.doctorfungus.org/thefungi/candida_spp.htm; Internet; accessed 18 Agustus
2007.
Engsterhold, Robert. “Untersucht Bacteria Gruppe: E. coli,” UL Online. Home page on-line. Available from http://wwwstud.uni-leipzig.de/~mai03kbz/bioinfprak/mainFrame.htm; Internet; accessed 18 Agustus 2007.
Ewald, Heather T. “Micro-organisms for
Education,” TCWM Online. Home
pageon-line. Available from http://www.science-projects.com/safemicrobes.htm; Internet; accessed 18 Agustus
2007.
Fardiaz, Srikandi. Analisis Mikrobiologi Pangan. Jakarta: PT
Raja Garfindo Persada, 1992.
Fardiaz, Srikandi. Mikrobiologi Pangan 1. Jakarta: PT
Gramedia Pustaka Utama, 1992.
Fardiaz,
Srikandi. Mikrobiologi Pengolahan Pangan Lanjut.
Bogor: IPB Press, 1992.
Johnson. “Carbohydrate Fermentation,” MicroVision Online. Home page on-line. Available from http://www.mc.maricopa.edu/~johnson/labtools/Dbiochem/cho.html; Internet; accessed 18 Agustus 2007.
Kim, H, J., dkk. “Characterization
of Bacillus cereus Isolates from Raw Soybean Sprouts,” Sproutnet Online.
Home page on-line. Available from http://www.sproutnet.com/Research/characterization_of_bacillus_cer.html; Internet; accessed 18 Agustus 2007.
Lay, Bibiana W. Analisis Mikroba di Laboratorium.
Jakarta: PT Raja Grafindo Persada, 1994.
Loi, Enrico. “Batteri,” ECplanet Online. Home page on-line. Available from http://www.ecplanet.com/canale/scienza-1/batteri-66/0/0/6855/it/ecplanet.rxdf
; Internet; accessed 18 Agustus 2007.
Mader, Algacyr M. “Culture Medium for Amylase
Production by Toxigenic Fungi,” Scielo
Online. Home page on-line. Available from http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-89132000000
500003; Internet; accessed 18 Agustus 2007.
Madigan, Michael T.,
John M. Martinko, and Jack Parker. Brock
Biology of Microrganisms. USA: Prentice Hall International, 1997.
Okumura, Yoshiyuki, dkk. “Isolation & Characterization of aNovel Acid
Proteinase, Tropiase from Candida Tropicalis IFO 0589,” JSMM Online. Home page on-line. Available from http://www.jsmm.org/common/jjmm48-1_019.pdf;
Internet; accessed 18 Agustus 2007.
Rodier, M. H, dkk. “Purification of an intracellular metallopeptidase of Mr
45000 in Fusarium moniliforme,” Cambridge Online. Home page on-line. Available from http://journals.cambridge.org/action/displayAbstract?fromPage=online&aid=41943;
Internet; accessed 18 Agustus 2007.
Rohmhaas. “Fusarium,” Rohmhaas Online. Home page on-line.
Available from http://www.rohmhaas.com/rhcis/markets_and_products/images/microorganisms/Gallery/fusarium_mycelium.jpg&imgrefurl;
Internet; accessed 18 Agustus 2007.
Rossbach. “Starch Hydrolysis
Medium,” Bios Online. Home page
on-line. Available from http://homepages.wmich.edu/~rossbach/bios312/LabProcedures/Starch%20Hydrolysis%20Medium.html;
Internet; accessed 18 Agustus 2007.
Tugmon, Cathy R. “Skim Milk Agar,” Biol Online. Home page on-line. Available from http://www.aug.edu/biology/skimmilkpage2.htm;
Internet; accessed 18 Agustus 2007.
Volk, Wesley A. dan Margaret F.
Wheeler. Mikrobiologi Dasar. Jilid 1.
Edisi kelima. Jakarta: Erlangga, 1993.
Winarno, F. G. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: PT
Gramedia Pustaka Utama, 1995.
No comments:
Post a Comment